高效液相色谱法测定片剂中补骨脂素和异补骨脂素含量
作者：方子季 林 静 代育存 刘振强
单位：(中国人民解放军海军第401医院 青岛266071)
关键词：高效液相色谱法；克白灵1号片；克白灵2号片；补骨脂素；异补骨脂素
中国医院药学杂志981111 摘要 目的:研究高效液相色谱法测定中药片剂中补骨脂素和异补骨脂素的含量。方法:用反相色谱法,检测波长248 nm;羟苯乙酯为内标;测定克白灵1号、2号片及腰痛片中的补骨脂素和异补骨脂素的含量。结果:三种片剂的回收率,补骨脂素为103.7%,99.4%,101.5%;异补骨脂素为99.9%,98.0%,96.8%。补骨脂素在4～120 μg.ml-1、异补骨脂素在3～100 μg.ml-1浓度范围内线性关系良好,r=0.999 9。结论:结果表明本法准确可靠,方法易行。
, http://www.100md.com
克白灵1号、2号片系我院自制的治疗白癜风系列制剂,各含有十余种中药;腰痛片为杭州胡庆余堂出产的中药糖衣片剂,其中均含有中药补骨脂。作者经实验建立了高效液相色谱法测定该三种制剂中的补骨脂素和异补骨脂素含量。
HPLC determination of psoralen and isopsoralen in Chinese patent medicines
Fang Ziji,Lin Jing,Dai Yucun,et al
(Naval Hospital 401 Qingdao P.R.China 266071)
Aim:To study an HPLC method for the determination of psoralen and isopsoralen in Chinese patent medicines.Method:An HPLC method with UV detection at 248 nm and ethylparaben as internal standard was established to determine the content of psoraten and isopsorulen in tablets of No.1,No.2 kebailing and anti-lumbago.Results:The average recoveries in the above three tablets were 103.7%,99.4%,101.5% for psoralen and 99.9%,98.0%,96.8% for isopsoralen,it was linear in the range of 4～120 μg.ml-1 for psoralen and 3～100 μg.ml-1 for isopsoralen with good correlation(r=0.999 9).Conclusion:The results showed this method is accurate,simple and repid.
, 百拇医药
Key words HPLC,tablet of No.1 and No.2 kebailing,psoralen,isopsoralen
1 仪器与试剂
日本岛津公司LC-6A高效液相色谱仪;补骨脂素和异补骨脂素对照品(中国药品生物制品检定所提供));羟苯乙酯(青岛医药公司提供);氯仿、无水乙醇(分析纯,青岛化学试剂厂);甲醇(紫外光学纯,上海振兴化工一厂);对照品贮备液:精密称取105 ℃干燥至恒重的补骨脂素和异补骨脂素对照品适量,用无水乙醇制成浓度分别为2.4 mg.ml-1和2.0 mg.ml-1的溶液,置4 ℃冰箱备用。内标贮备液:精密称取羟苯乙酯适量制成0.25 mg.ml-1的无水乙醇溶液,置4 ℃冰箱备用。
2 方法与结果
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2.1 色谱条件 YWP色谱柱(4.6 mm×20 mm),C18保护柱,柱温35 ℃,流动相甲醇-水(40∶60),流速1.3 ml.min-1,检测波长248 nm,量程0.04 AUFS,纸速1 mm.min-1。补骨脂素和异补骨脂素的保留时间分别为14 min和16 min,分离度1.6,理论塔板数以内标峰计算为1 363,内标峰保留时间为12 min。
2.2 线性关系的测定 准确配制6种不同浓度对照品无水乙醇溶液(4,10,20,40,60,120 μg.ml-1),加适量内标物使成50 μg.ml-1浓度。每次进样6 μl,每一浓度进样3次。记录色谱图,求得对照品峰面积为内标物峰面积的比值关于进样浓度的回归方程。补骨脂素回归方程:
Y=-2.983×10-2+2.805×10-2X,r=0.999 9。
, 百拇医药
异补骨脂素回归方程:
Y=5.976×10-3+3.617×10-2X,r=0.999 9。
2.3 加样回收实验 取三种样品各3份,分别加入对照品贮备液适量,按样品测定方法处理并加入内标物后,进行测定每份检品重复测定3次。
表 1 三种片剂中补骨脂素、异补骨脂素的回收率及精密度 样 品
组 份
加入浓度
μg
测定值
μg
, 百拇医药 回收率
%
±s
%
RSD
%
组 份
加入浓度
μg
测定值
μg
回收率
%±s
, http://www.100md.com
%
RSD
%
克白灵1号
补骨脂素
125
131.0
104.8
异补骨脂素
125
118.5
94.8
克白灵1号
, http://www.100md.com
补骨脂素
300
310.3
103.4
103.7
1.1
异补骨脂素
300
313.3
104.3
99.9
5.3
克白灵1号
, http://www.100md.com
补骨脂素
400
412.6
103.4
异补骨脂素
400
402.6
100.6
克白灵2号
补骨脂素
80
78.5
98.1
, http://www.100md.com
异补骨脂素
80
79.6
99.5
克白灵2号
补骨脂素
130
136.0
104.6
99.4
5.2
异补骨脂素
130
, http://www.100md.com
128.0
98.5
98.0
1.9
克白灵2号
补骨脂素
250
238.0
95.4
异补骨脂素
250
240.4
96.1
, 百拇医药
腰痛片
补骨脂素
75
73.05
97.4
异补骨脂素
75
71.2
94.8
腰痛片
补骨脂素
125
126.5
, 百拇医药
101.2
101.5
4.2
异补骨脂素
125
122.0
97.6
96.8
1.2
腰痛片
补骨脂素
380
402.1
, http://www.100md.com
105.8
异补骨脂素
380
372.4
98.0
2.4 样品测定 取经四号筛并105 ℃干燥3 h的片剂粉末约0.5 g,精密称定,加氯仿100 ml于水浴上回流煮沸3 h,再移至索氏提取器,回流提取2 h。将提取液置蒸发皿中,于水浴蒸干,加无水乙醇分次溶解剩余物并移至5 ml量瓶中,加羟苯乙酯内标液(250 μg.ml-1)1 ml,加无水乙醇至刻度,摇匀后进样,记录色谱图。按回归方程分别计算补骨脂素和异补骨脂素的含量。测定结果见表2。表 2 三种片剂中补骨脂素、异补骨脂素的含量 样 品
批 号
, 百拇医药
(补骨)/(脂素)
μg
%
RSD
%
(异补骨)/(脂素)
μg
%
RSD
%
克白灵1号
, 百拇医药
941223
168.8
275.8
克白灵1号
941223
167.4
286.0
克白灵1号
941223
170.0
168.7
0.8
286.0
, 百拇医药
282.6
2.4
克白灵2号
950109
350.0
419.3
克白灵2号
950109
342.4
414.7
克白灵2号
950109
345.0
, http://www.100md.com
345.8
1.2
414.6
416.2
0.7
腰痛片
951108-3
231.2
335.7
腰痛片
951108-3
225.3
334.5
, 百拇医药
腰痛片
951108-3
221.0
225.8
2.4
350.7
340.3
3.1
3 讨论
3.1 提取条件的选择 曾以超声处理30 min的方法比较了氯仿、乙醇、二氯乙烷、苯等四种溶剂对克白灵1号片剂中补骨脂素及异补骨脂素的提取效率,结果以氯仿最高。以氯仿为溶剂比较了克白灵2号片超声提取3次共90 min,索氏提取3 h及先回流煮沸3 h再索氏提取2 h的提取效率,结果见表3。
, 百拇医药
表 3 三种提取方法提出率的比较(n=3) 组 分
超声3次
索氏提取
先回流煮沸后
索氏提取
补骨脂素
1
2.1
3.01
异补骨脂素
1
1.65
1.84
, http://www.100md.com
先回流煮沸(水浴)提取温度较索氏提取为高,故提取较完全,然后再经索氏提取可除去提取液中的中药,减少其所占体积带来的误差,本法效果最佳。
3.2 检测波长与内标物的选择 据报道[1],用295 nm波长,以氯霉素为内标测定补骨脂酊,作者也曾用该方法测定克白酊获得成功,但测定上述片剂时,精度较差,这是因为这几种片剂成份更复杂,在其色谱图中,氯霉素内标峰处杂质峰较密集所致。文献报道[2],异补骨脂素在246 nm和298 nm处有吸收峰,补骨脂素与异补骨脂素相似。实测证明248 nm较295 nm灵敏度高,相同浓度样品248 nm处峰面积约为295 nm处峰面积的2倍,248 nm线性范围低限为3～4 μg.ml-1,而295 nm为10 μg.ml-1。羟苯乙酯tR为12 min,该处无杂质峰,测定时精度较好,且与补骨脂素及补骨脂素与异补骨脂素的分离度均大于1.5,符合中国药典要求。
, 百拇医药
3.3 流动相配比与色谱行为的关系(见表4)
补骨脂素与异补骨脂素为同分异构体,理化性质颇相似,较难分离,水的比例增加,可使分离度增大,但保留时间亦延长。为此,选择甲醇-水(40∶60)的配比,同时提高柱温到35 ℃,流速1.3 ml.min-1,测定可在20 min以内完成。若流速增至1.5 ml.min-1,tR可缩短至13,15 min,但柱压可高达130 kgf.cm-2,不利于柱的保护。
表 4 甲醇-水的配比与色谱行为的关系(室温,248 nm) 甲醇∶水
补骨脂素tR
min
, http://www.100md.com
异补骨脂素tR
min
分离度
R
70∶30
3.8
3.9
不可分
50∶50
7.9
9.0
0.84
40∶50
, http://www.100md.com
15.5
17.6
1.62
40∶60
18.5
21.2
2.1
注:流速1.3 ml.min-1
3.4 专属性考查 在本文选定的色谱条件下,所取制剂除补骨脂以外成份,照上述方法操作,记录色谱图,色谱图表明其它成份不干扰测定。
参考文献
1 谭生建,王 琰,刘 刚等.补骨脂酊中补骨脂素和异补骨脂素的高效液相色谱测定法.中国中药杂志,1995,2(20):99
2 王 宝等.中成药质量标准与标准物质.北京:中国医药科技出版社,1994,512
(1997年11月5日收稿), 百拇医药
单位：(中国人民解放军海军第401医院 青岛266071)
关键词：高效液相色谱法；克白灵1号片；克白灵2号片；补骨脂素；异补骨脂素
中国医院药学杂志981111 摘要 目的:研究高效液相色谱法测定中药片剂中补骨脂素和异补骨脂素的含量。方法:用反相色谱法,检测波长248 nm;羟苯乙酯为内标;测定克白灵1号、2号片及腰痛片中的补骨脂素和异补骨脂素的含量。结果:三种片剂的回收率,补骨脂素为103.7%,99.4%,101.5%;异补骨脂素为99.9%,98.0%,96.8%。补骨脂素在4～120 μg.ml-1、异补骨脂素在3～100 μg.ml-1浓度范围内线性关系良好,r=0.999 9。结论:结果表明本法准确可靠,方法易行。
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克白灵1号、2号片系我院自制的治疗白癜风系列制剂,各含有十余种中药;腰痛片为杭州胡庆余堂出产的中药糖衣片剂,其中均含有中药补骨脂。作者经实验建立了高效液相色谱法测定该三种制剂中的补骨脂素和异补骨脂素含量。
HPLC determination of psoralen and isopsoralen in Chinese patent medicines
Fang Ziji,Lin Jing,Dai Yucun,et al
(Naval Hospital 401 Qingdao P.R.China 266071)
Aim:To study an HPLC method for the determination of psoralen and isopsoralen in Chinese patent medicines.Method:An HPLC method with UV detection at 248 nm and ethylparaben as internal standard was established to determine the content of psoraten and isopsorulen in tablets of No.1,No.2 kebailing and anti-lumbago.Results:The average recoveries in the above three tablets were 103.7%,99.4%,101.5% for psoralen and 99.9%,98.0%,96.8% for isopsoralen,it was linear in the range of 4～120 μg.ml-1 for psoralen and 3～100 μg.ml-1 for isopsoralen with good correlation(r=0.999 9).Conclusion:The results showed this method is accurate,simple and repid.
, 百拇医药
Key words HPLC,tablet of No.1 and No.2 kebailing,psoralen,isopsoralen
1 仪器与试剂
日本岛津公司LC-6A高效液相色谱仪;补骨脂素和异补骨脂素对照品(中国药品生物制品检定所提供));羟苯乙酯(青岛医药公司提供);氯仿、无水乙醇(分析纯,青岛化学试剂厂);甲醇(紫外光学纯,上海振兴化工一厂);对照品贮备液:精密称取105 ℃干燥至恒重的补骨脂素和异补骨脂素对照品适量,用无水乙醇制成浓度分别为2.4 mg.ml-1和2.0 mg.ml-1的溶液,置4 ℃冰箱备用。内标贮备液:精密称取羟苯乙酯适量制成0.25 mg.ml-1的无水乙醇溶液,置4 ℃冰箱备用。
2 方法与结果
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2.1 色谱条件 YWP色谱柱(4.6 mm×20 mm),C18保护柱,柱温35 ℃,流动相甲醇-水(40∶60),流速1.3 ml.min-1,检测波长248 nm,量程0.04 AUFS,纸速1 mm.min-1。补骨脂素和异补骨脂素的保留时间分别为14 min和16 min,分离度1.6,理论塔板数以内标峰计算为1 363,内标峰保留时间为12 min。
2.2 线性关系的测定 准确配制6种不同浓度对照品无水乙醇溶液(4,10,20,40,60,120 μg.ml-1),加适量内标物使成50 μg.ml-1浓度。每次进样6 μl,每一浓度进样3次。记录色谱图,求得对照品峰面积为内标物峰面积的比值关于进样浓度的回归方程。补骨脂素回归方程:
Y=-2.983×10-2+2.805×10-2X,r=0.999 9。
, 百拇医药
异补骨脂素回归方程:
Y=5.976×10-3+3.617×10-2X,r=0.999 9。
2.3 加样回收实验 取三种样品各3份,分别加入对照品贮备液适量,按样品测定方法处理并加入内标物后,进行测定每份检品重复测定3次。
表 1 三种片剂中补骨脂素、异补骨脂素的回收率及精密度 样 品
组 份
加入浓度
μg
测定值
μg
, 百拇医药 回收率
%
±s%
RSD
%
组 份
加入浓度
μg
测定值
μg
回收率
%
±s, http://www.100md.com
%
RSD
%
克白灵1号
补骨脂素
125
131.0
104.8
异补骨脂素
125
118.5
94.8
克白灵1号
, http://www.100md.com
补骨脂素
300
310.3
103.4
103.7
1.1
异补骨脂素
300
313.3
104.3
99.9
5.3
克白灵1号
, http://www.100md.com
补骨脂素
400
412.6
103.4
异补骨脂素
400
402.6
100.6
克白灵2号
补骨脂素
80
78.5
98.1
, http://www.100md.com
异补骨脂素
80
79.6
99.5
克白灵2号
补骨脂素
130
136.0
104.6
99.4
5.2
异补骨脂素
130
, http://www.100md.com
128.0
98.5
98.0
1.9
克白灵2号
补骨脂素
250
238.0
95.4
异补骨脂素
250
240.4
96.1
, 百拇医药
腰痛片
补骨脂素
75
73.05
97.4
异补骨脂素
75
71.2
94.8
腰痛片
补骨脂素
125
126.5
, 百拇医药
101.2
101.5
4.2
异补骨脂素
125
122.0
97.6
96.8
1.2
腰痛片
补骨脂素
380
402.1
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105.8
异补骨脂素
380
372.4
98.0
2.4 样品测定 取经四号筛并105 ℃干燥3 h的片剂粉末约0.5 g,精密称定,加氯仿100 ml于水浴上回流煮沸3 h,再移至索氏提取器,回流提取2 h。将提取液置蒸发皿中,于水浴蒸干,加无水乙醇分次溶解剩余物并移至5 ml量瓶中,加羟苯乙酯内标液(250 μg.ml-1)1 ml,加无水乙醇至刻度,摇匀后进样,记录色谱图。按回归方程分别计算补骨脂素和异补骨脂素的含量。测定结果见表2。表 2 三种片剂中补骨脂素、异补骨脂素的含量 样 品
批 号
, 百拇医药
(补骨)/(脂素)
μg
%
RSD
%
(异补骨)/(脂素)
μg
%
RSD
%
克白灵1号
, 百拇医药
941223
168.8
275.8
克白灵1号
941223
167.4
286.0
克白灵1号
941223
170.0
168.7
0.8
286.0
, 百拇医药
282.6
2.4
克白灵2号
950109
350.0
419.3
克白灵2号
950109
342.4
414.7
克白灵2号
950109
345.0
, http://www.100md.com
345.8
1.2
414.6
416.2
0.7
腰痛片
951108-3
231.2
335.7
腰痛片
951108-3
225.3
334.5
, 百拇医药
腰痛片
951108-3
221.0
225.8
2.4
350.7
340.3
3.1
3 讨论
3.1 提取条件的选择 曾以超声处理30 min的方法比较了氯仿、乙醇、二氯乙烷、苯等四种溶剂对克白灵1号片剂中补骨脂素及异补骨脂素的提取效率,结果以氯仿最高。以氯仿为溶剂比较了克白灵2号片超声提取3次共90 min,索氏提取3 h及先回流煮沸3 h再索氏提取2 h的提取效率,结果见表3。
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表 3 三种提取方法提出率的比较(n=3) 组 分
超声3次
索氏提取
先回流煮沸后
索氏提取
补骨脂素
1
2.1
3.01
异补骨脂素
1
1.65
1.84
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先回流煮沸(水浴)提取温度较索氏提取为高,故提取较完全,然后再经索氏提取可除去提取液中的中药,减少其所占体积带来的误差,本法效果最佳。
3.2 检测波长与内标物的选择 据报道[1],用295 nm波长,以氯霉素为内标测定补骨脂酊,作者也曾用该方法测定克白酊获得成功,但测定上述片剂时,精度较差,这是因为这几种片剂成份更复杂,在其色谱图中,氯霉素内标峰处杂质峰较密集所致。文献报道[2],异补骨脂素在246 nm和298 nm处有吸收峰,补骨脂素与异补骨脂素相似。实测证明248 nm较295 nm灵敏度高,相同浓度样品248 nm处峰面积约为295 nm处峰面积的2倍,248 nm线性范围低限为3～4 μg.ml-1,而295 nm为10 μg.ml-1。羟苯乙酯tR为12 min,该处无杂质峰,测定时精度较好,且与补骨脂素及补骨脂素与异补骨脂素的分离度均大于1.5,符合中国药典要求。
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3.3 流动相配比与色谱行为的关系(见表4)
补骨脂素与异补骨脂素为同分异构体,理化性质颇相似,较难分离,水的比例增加,可使分离度增大,但保留时间亦延长。为此,选择甲醇-水(40∶60)的配比,同时提高柱温到35 ℃,流速1.3 ml.min-1,测定可在20 min以内完成。若流速增至1.5 ml.min-1,tR可缩短至13,15 min,但柱压可高达130 kgf.cm-2,不利于柱的保护。
表 4 甲醇-水的配比与色谱行为的关系(室温,248 nm) 甲醇∶水
补骨脂素tR
min
, http://www.100md.com
异补骨脂素tR
min
分离度
R
70∶30
3.8
3.9
不可分
50∶50
7.9
9.0
0.84
40∶50
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15.5
17.6
1.62
40∶60
18.5
21.2
2.1
注:流速1.3 ml.min-1
3.4 专属性考查 在本文选定的色谱条件下,所取制剂除补骨脂以外成份,照上述方法操作,记录色谱图,色谱图表明其它成份不干扰测定。
参考文献
1 谭生建,王 琰,刘 刚等.补骨脂酊中补骨脂素和异补骨脂素的高效液相色谱测定法.中国中药杂志,1995,2(20):99
2 王 宝等.中成药质量标准与标准物质.北京:中国医药科技出版社,1994,512
(1997年11月5日收稿), 百拇医药
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