去甲斑蝥素诱导人肝癌BEL-7402细胞凋亡的研究*
作者：孙震晓 赵天德 魏育林 李家实
单位：孙震晓(山东聊城师范学院生物系，聊城 252059)；赵天德 魏育林(中日友好临床医学研究所，北京)；李家实(北京中医药大学中药学院，北京)
关键词：去甲斑蝥素；人肝癌细胞；凋亡；Bcl-2
解剖学报990117
【摘要】 目的 研究新型抗癌药物去甲斑蝥素抑制人肝癌(BEL-7402)细胞生长的机制。 方法 从细胞的形态学观察和DNA琼脂糖凝胶电泳等方面考察去甲斑蝥素作用人肝癌细胞的特点，并进一步用免疫细胞化学及Western blotting等分析手段研究癌基因蛋白Bcl-2在此过程中的表达情况。 结果 10mg/L去甲斑蝥素作用人肝癌细胞24h，部分细胞出现固缩、细胞质膜突起、核染色质异常凝集等，并伴有膜包被的凋亡小体的形成。DNA琼脂糖凝胶电泳显示，处理组部分细胞的DNA已降解成以约200bp为基数的DNA片断，呈现典型的“梯状”带纹。免疫细胞化学及Western blotting分析显示该过程伴随癌基因蛋白Bcl-2表达的减弱。 结论 新型抗癌药物去甲斑蝥素可以诱导人肝癌细胞发生凋亡，该凋亡过程与癌基因蛋白Bcl-2表达下调相关。
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STUDY ON APOPTOSIS OF HUMAN HEPATOMA CELLS (BEL-7402)
INDUCED BY NORCANTHARIDIN
Sun Zhenxiao，Zhao Tiande*，Wei Yulin*，Li Jiashi△
(Liaocheng Teacher's University,Liaocheng 252059;China-Japan Friendship Institute of
Clinical Medical Sciences,Beijing;Beijing University of Traditional Chinese Medicine,Beijing)
, 百拇医药
【Abstract】 Objective We tried to probe the antitumor mechanisms of new antitumor drug norcantharidin(NCTD) on human hepatoma (BEL-7402) cells. Methods By morphological observation and DNA agarose gel electrophoresis, we examined the characteristics of NCTD on human hepatoma cells, then determined the expression of oncoprotein Bcl-2 by immunocytochemical and Western blotting analysis in this process. Results Treated with 10mg/L NCTD for 24h, some human hepatoma cells condensed with membrane budding, the nuclear chromatin compaction and membrane-enclosed apoptotic bodies formation, and fragments that were multiples of units comprising about 200 base pairs were detected by agarose gel electrophoresis, a characteristic ladder being evident when ethidium bromide-stained gels were viewed in ultraviolet light. The expression of oncoprotein Bcl-2 was proved decreasing in human hepatoma cells at this time. Conclusion The new antitumor drug NCTD can induce apoptosis in human hepatoma cells, and the declining expression of oncoprotein Bcl-2 might involve in this process.
, 百拇医药
【Key words】 Norcantharidin; Human hepatoma cell; Apoptosis; Bcl-2
去甲斑蝥素(norcantharidine, NCTD)为全人工合成的一种抗癌活性成分，与中药抗癌活性成分斑蝥素(cantharidine, CA)相比，缺少1，2位的两个甲基，立体构型相同[1，2]。去甲斑蝥素克服了斑蝥素刺激泌尿系统的副作用，临床上用于治疗多种消化道肿瘤，以原发性肝癌为主，显示了较好疗效[3，4]。作为抗癌药物，去甲斑蝥素不同于其他化疗药物之处在于它对正常骨髓细胞不但没有抑制作用，反而有很好的刺激其生长效应[5，6]，抗癌机理颇为独特。我们在实验中发现去甲斑蝥素能够诱导人肝癌BEL-7402细胞凋亡，进一步研究这一现象，对揭示去甲斑蝥素的抗癌机制及指导其临床应用等有重要意义。
材料和方法
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1.细胞系及培养条件
人肝癌BEL-7402细胞系(中日友好临床医学研究所细胞生物室冻存)接种于含20%小牛血清及100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素的RPMI-1640培养液中，在37℃、含5%CO2的培养箱内培养传代。加药均在细胞对数生长期内进行。
2.药品与试剂
去甲斑蝥素(北京第四制药厂王广生教授惠赠)，在RPMI-1640内溶解，抽滤灭菌，-20℃保存。RNaseA和Proteinase K(E Merck)按分子克隆操作指南[7]分别配成10g/L和20g/L,-20℃存放。
3.剂量反应曲线
按参考文献[8]，取培养的肝癌细胞，以4×104/ml的密度接种于96孔板，每孔180μl。待细胞贴壁后，各孔继加20μl不同浓度的待试药物，每个稀释度作8个平行孔。置含5%CO2的37℃培养箱中培养48h。倒出培养液，生理盐水洗3次，每孔加入NAG酶反应底物保存液50μl，37℃继续孵育4h后，每孔再加入80μl酶反应终止液，立即置日本NJ-2000型酶标仪中测定各孔的OD值(检测波长405nm，参比波长490nm)。以不同浓度药物作用的培养孔的平均OD值对药物浓度作图，实验重复3次。
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4.细胞DNA片断的提取及琼脂糖凝胶电泳
参照文献[9]收集DNA片段，在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳，恒压33V；紫外透射仪上观察并摄片。
5.细胞形态学观察
5.1 一般形态学观察：收集适量细胞，离心涂片，风干固定。贴壁细胞，直接倒掉培养液，取出细胞附着的盖片，PBS洗。单层细胞标本以Wright-Giemsa染色，光镜下观察。
5.2 超微结构观察：细胞经常规2.5%戊二醛与1%锇酸固定后，逐级浓度酒精脱水，Spury Resin树脂包埋，超薄切片，枸橼酸铅-醋酸双氧铀电子染色，JEM-1200EX透射电镜观察。
6.免疫细胞化学法检测凋亡相关蛋白的表达
常规SABC法测定。用PLP(过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛)固定液固定细胞，一抗为兔抗人Bcl-2(1∶50, Santa Cruz Biotechnology, Inc),湿盒中4℃冰箱过夜。滴加生物素化二抗(1∶200, Vector laboratories, Inc)，室温30min，滴加辣根酶标记链霉亲和素(1∶400, Vector laboratories, Inc)，室温30min，DAB显色。结果经LEITZ DMRBE型显微分光光度计(Leica)定量：每组取3～5张有代表性的标本，随机框取90个细胞测定其平均光密度，结果用t检验统计分析。
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7.Western blotting分析
离心收集细胞约5×106个，加入100μl 2×点样缓冲液，沸水中煮10min，使细胞裂解，每个点样孔加25μl样品液，12.5%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。凝胶上的蛋白带转移到硝酸纤维素膜上，封闭液封闭膜上的免疫球蛋白结合位点，过夜。加入特异性的一抗(兔抗Bcl-2，1∶1 000)、生物素化二抗(1∶2 000)及辣根酶标记链霉亲和素(1∶2 000)，DAB显色。
结果
1.去甲斑蝥素对肝癌细胞的增殖抑制作用
图1示去甲斑蝥素作用BEL-7402细胞48h时剂量反应曲线，可见随着剂量的增加，去甲斑蝥素对肝癌细胞的抑制作用也明显增强。
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图1 去甲斑蝥素作用人肝癌BEL-7402细胞48h时的剂量反应曲线
Fig.1 Growth inhibition effect of increasing concentrations of
NCTD on the human hepatoma BEL-7402 cells at 48h. Points
are the mean of triplicate assays.
2.DNA琼脂糖凝胶电泳
如图2所示，10mg/L去甲斑蝥素处理BEL-7402细胞24h，可见以约200bp为基数的DNA片断组成的“梯状”带纹(ladder),而对照组没有。
3.细胞的形态学变化
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图3示正常对照组的BEL-7402细胞形态：细胞贴壁生长，胞浆伸展，境界清楚，基本形成致密单层。10mg/L去甲斑蝥素作用24h后(图4)，细胞收缩变形、脱壁，并出现一系列特殊的形态学变化：细胞多发生M期阻滞，一些细胞核染色体出现多极分离，部分染色体断裂，形成大小不一的染色质小块散在于胞浆中，部分细胞固缩，视野中还可以看到包有部分胞浆和染色质凝集块的小体，这些特征均与文献[10，11]报道的细胞凋亡时的形态学变化极为相似。图5示1个放大的正在凋亡的BEL-7402细胞，可见许多染色质小块靠细胞膜边集，细胞膜成泡状突出。电镜下，去甲斑蝥素处理组细胞膜表面微绒毛消失，细胞出现明显的固缩、染色质异常凝集、胞浆空泡化，可见形成的包有部分胞浆和部分染色质凝集块的小体(图6)。图7示正常对照组中1个分裂间期细胞的超微结构特征：细胞膜表面有较多细长微绒毛，细胞核大，核膜、核仁结构清晰，胞浆内分布有结构清晰的线粒体、内质网等细胞器。
4.免疫细胞化学及Western blotting分析Bcl-2蛋白的表达
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免疫细胞化学染色显示，Bcl-2蛋白存在部位有棕黄色反应物。阴性对照组无表达，正常对照组细胞染色呈棕褐色，表明它大量存在于这些细胞中。10mg/L去甲斑蝥素处理24h，细胞染色处于阴性对照组和正常对照组之间，呈浅棕黄色，表明处理组细胞中Bcl-2蛋白的表达仍较强，但与正常对照组相比，已有显著性差异：正常对照组细胞的平均光密度为0.12±0.01(n=90)，处理组细胞的平均光密度为0.08±0.01(n=90)，处理组中Bcl-2蛋白的表达明显低于正常对照组(P<0.001)。图8示Western blotting分析结果，可见10mg/L去甲斑蝥素处理BEL-7402细胞24h，仍可见Bcl-2蛋白的较强表达，但48h和72h，Bcl-2蛋白的表达已急剧减弱。
讨论
细胞凋亡是细胞主动参与并遵循一定程序的自我消亡过程，有其独特的形态和生化特征。形态学上最重要的是细胞核染色质异常凝集，核固缩、碎裂等，继而通过形成凋亡小体而消亡，生化特征最重要的是由于Ca2+、Mg2+依赖性的核酸内切酶的激活导致的核小体间DNA的断裂，DNA琼脂糖凝胶电泳时会出现规则的“梯状”带纹，我们对照这两方面特征，认为去甲斑蝥素是通过诱导BEL-7402细胞凋亡而抑制其生长的。
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近年来，关于细胞凋亡的基因调控机制研究已取得一些初步成果，有资料显示，癌基因bcl-2、c-myc、抑癌基因p53等可能在某些情况下参与了细胞凋亡过程[12]。在去甲斑蝥素诱导BEL-7402细胞凋亡过程中，我们发现，Bcl-2蛋白表达的变化非常显著，随着去甲斑蝥素作用时间的延长，处理组细胞中的Bcl-2蛋白表达下降，与细胞凋亡的发生发展进程相平行。以往的研究表明，癌基因bcl-2是一个凋亡抑制基因，它在多种肿瘤细胞中过度表达，使本该凋亡的细胞凋亡受阻，最终诱发肿瘤，而且，它的强表达还影响肿瘤细胞的抗药性。Dole等[13]用bcl-2表达载体(pSFFV-neo-bcl-2)转染bcl-2阴性人类神经母细胞瘤(NBL)细胞株(shep-1)，发现高水平bcl-2的克隆对cisplatin和etoposide引起的细胞毒性呈剂量依赖性阻抗，因此我们认为Bcl-2蛋白表达的这种减弱可能在去甲斑蝥素诱导的BEL-7402细胞凋亡过程中起重要作用。
细胞凋亡是一个连续的过程，在体内或对于没有同步化处理的培养细胞，同一时相可以看到发育不同时期的凋亡细胞(图4)。体外培养的人肝癌细胞经去甲斑蝥素作用后，首先变圆浮起，离心涂片后染色观察，发现这些细胞大多处于有丝分裂期。随着药物作用时间的延长，处理组细胞不断变圆浮起，而原来变圆的细胞不断地开始变形，表面突起，染色体多极分离、断裂，继而凝集成大小不一的块状，并不断形成包有部分胞浆或染色质块的小体。据此我们推测，去甲斑蝥素使人肝癌细胞发生M期阻滞与诱导其发生凋亡密切相关，进一步阐明这两者关系的研究正在进行中。
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图版说明
图2 BEL-7402细胞DNA琼脂糖凝胶电泳。M：分子量标准，pBR322 HinfI酶切，1：对照组，2：10mg/L NCTD作用24h
图3 对照组贴壁生长的BEL-7402细胞，W-G染色 ×350
图4 BEL-7402细胞经10mg/L NCTD作用24h后形态学变化。部分细胞有丝分裂后期染色体呈多极分离(↑)，有些染色体断裂，凝集形成大小不一的染色质小块散落在胞浆中(▲)，部分细胞固缩(↑)，可见形成的包有部分胞浆和染色质小块的凋亡小体(AB)，W-G染色 ×350
图5 10mg/L NCTD作用24h，示1个正在凋亡的BEL-7402细胞，可见其染色质凝集块靠细胞膜边集，细胞膜呈泡状突出，W-G染色 ×880
图6 示电镜下，10mg/L NCTD作用24h后BEL-7402细胞发生凋亡，形成的凋亡小体：染色质凝集，胞浆浓缩，凋亡细胞(↑)内质网扩张 ×14 000
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图7 示电镜下，对照组中1个间期BEL-7402细胞，可见其细胞核(N)、线粒体(M)、内质网(Er)等结构清晰 ×16 000
图8 Western blotting显示BEL-7402细胞中Bcl-2蛋白的表达。A：对照组，B:10mg/L NCTD作用24h，C：10mg/L NCTD作用48h，D：10mg/L NCTD作用72h。
Ecplanation of figures
Fig.2 Agarose gel electrophoresis of DNA extracted from BEL-7402 cells. M:DNA marker; 1:control group; 2:treated with 10μg/ml NCTD for 24h.
Fig.3 Control BEL-7402 cells, W-G staining ×350
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Fig.4 BEL-7402 cells treated with 10μg/ml NCTD for 24h. (↑)indicates multipolar distribution of chromosomes in postmitotic cells, (▲)indicates nuclear fragments in apoptotic cells, (↑) indicates condensed cells, (AB) indicates apoptotic bodies which containing one or two nuclear fragments. W-G staining ×350
Fig.5 An apoptotic BEL-7402 cell, some nuclear fragments moved to cell membrane which giving a bubbling aspect to the cell surface. W-G staining ×880
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Fig.6 Ultrastructural features of BEL-7402 cells treated with 10μg/ml NCTD for 24h. Endoplasmic reticulum (Er) dilated in the apoptotic cell(↑), the apoptotic bodies characterized by compaction of nuclear chromatin and condensation of cytoplasm ×14 000
Fig.7 Ultrastructural features of a BEL-7402 cell in control group. Note the clear structure of cell nucleus(N), mitochondrion(M), and Endoplasmic reticulum(Er) ×16 000
Fig.8 Western blotting analysis of Bcl-2 protein in BEL-7402 cells. A:control; B:treated with 10 mg/L NCTD for 24h; C:treated with 10 mg/L NCTD for 48h; D:treated with 10 mg/L NCTD for 72h
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* 高等学校博士学科点专项科研基金资助课题
△ Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029, China
参考文献
[1]Wang GS. Medical uses of mylabris in ancient China and recent studies. J Ethnopharmacology, 1989,26:147
[2]刘毅，凌仰之.外型去甲斑蝥素的合成.中国医药工业杂志，1991，22(1)：8
[3]杨敏一，梁宝英，余清平，等.去甲斑蝥素治疗原发性肝癌45例1年随访观察.实用内科杂志，1990，10(1)：25
, 百拇医药
[4]杨敏一，吴真，梁宝英，等.去甲斑蝥素口服及瘤体中心注射治疗原发性肝癌的临床观察.山东医药工业，1992，11(1)：45
[5]王广生，董成，张贺忠，等.去甲斑蝥素升高白细胞作用的研究.药学通报，1987，22(9)：517
[6]Liu XH, Blazsek I, Comisso M, et al. Effects of norcantharidin, a protein phosphatase type-2A inhibitor, on the growth of normal and malignant haemopoietic cells. EJC, 1995,31A(6):953
[7]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning (A laboratory Manual). Vol.3. 2ed. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989,B:16-17
, 百拇医药
[8]魏育林，赵天德，金恩源，等.促肝细胞生长素诱导人肝癌细胞(BEL-7402)凋亡.上海免疫学杂志，1996，16(1)：33
[9]Herrmann M, Lornz HM, Voll R, et al. A rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acids Res, 1994,22(24):5506
[10]Gerschenson LE, Rotello RJ. Apoptosis: a different type of cell death. FASEB J, 1992,6:2450
[11]Bergamaschi G, Rosti V, Danova M, et al. Apoptosis: biological and clinical aspects. Haematologica, 1994, 79:86
[12]Kerr JFR, Winterford CM, Harmon BV. Apoptosis: its significance in cancer and cancer therapy. Cancer, 1994,73(8):2013
[13]Dole M, Nunez G, Merchant AK, et al. Bcl-2 inhibits chemotherapy-induced apoptosis in neuroblastoma. Cancer Res, 1994,54:3253
收稿1997-11 修回1998-03, 百拇医药
单位：孙震晓(山东聊城师范学院生物系，聊城 252059)；赵天德 魏育林(中日友好临床医学研究所，北京)；李家实(北京中医药大学中药学院，北京)
关键词：去甲斑蝥素；人肝癌细胞；凋亡；Bcl-2
解剖学报990117
【摘要】 目的 研究新型抗癌药物去甲斑蝥素抑制人肝癌(BEL-7402)细胞生长的机制。 方法 从细胞的形态学观察和DNA琼脂糖凝胶电泳等方面考察去甲斑蝥素作用人肝癌细胞的特点，并进一步用免疫细胞化学及Western blotting等分析手段研究癌基因蛋白Bcl-2在此过程中的表达情况。 结果 10mg/L去甲斑蝥素作用人肝癌细胞24h，部分细胞出现固缩、细胞质膜突起、核染色质异常凝集等，并伴有膜包被的凋亡小体的形成。DNA琼脂糖凝胶电泳显示，处理组部分细胞的DNA已降解成以约200bp为基数的DNA片断，呈现典型的“梯状”带纹。免疫细胞化学及Western blotting分析显示该过程伴随癌基因蛋白Bcl-2表达的减弱。 结论 新型抗癌药物去甲斑蝥素可以诱导人肝癌细胞发生凋亡，该凋亡过程与癌基因蛋白Bcl-2表达下调相关。
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INDUCED BY NORCANTHARIDIN
Sun Zhenxiao，Zhao Tiande*，Wei Yulin*，Li Jiashi△
(Liaocheng Teacher's University,Liaocheng 252059;China-Japan Friendship Institute of
Clinical Medical Sciences,Beijing;Beijing University of Traditional Chinese Medicine,Beijing)
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【Abstract】 Objective We tried to probe the antitumor mechanisms of new antitumor drug norcantharidin(NCTD) on human hepatoma (BEL-7402) cells. Methods By morphological observation and DNA agarose gel electrophoresis, we examined the characteristics of NCTD on human hepatoma cells, then determined the expression of oncoprotein Bcl-2 by immunocytochemical and Western blotting analysis in this process. Results Treated with 10mg/L NCTD for 24h, some human hepatoma cells condensed with membrane budding, the nuclear chromatin compaction and membrane-enclosed apoptotic bodies formation, and fragments that were multiples of units comprising about 200 base pairs were detected by agarose gel electrophoresis, a characteristic ladder being evident when ethidium bromide-stained gels were viewed in ultraviolet light. The expression of oncoprotein Bcl-2 was proved decreasing in human hepatoma cells at this time. Conclusion The new antitumor drug NCTD can induce apoptosis in human hepatoma cells, and the declining expression of oncoprotein Bcl-2 might involve in this process.
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【Key words】 Norcantharidin; Human hepatoma cell; Apoptosis; Bcl-2
去甲斑蝥素(norcantharidine, NCTD)为全人工合成的一种抗癌活性成分，与中药抗癌活性成分斑蝥素(cantharidine, CA)相比，缺少1，2位的两个甲基，立体构型相同[1，2]。去甲斑蝥素克服了斑蝥素刺激泌尿系统的副作用，临床上用于治疗多种消化道肿瘤，以原发性肝癌为主，显示了较好疗效[3，4]。作为抗癌药物，去甲斑蝥素不同于其他化疗药物之处在于它对正常骨髓细胞不但没有抑制作用，反而有很好的刺激其生长效应[5，6]，抗癌机理颇为独特。我们在实验中发现去甲斑蝥素能够诱导人肝癌BEL-7402细胞凋亡，进一步研究这一现象，对揭示去甲斑蝥素的抗癌机制及指导其临床应用等有重要意义。
材料和方法
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1.细胞系及培养条件
人肝癌BEL-7402细胞系(中日友好临床医学研究所细胞生物室冻存)接种于含20%小牛血清及100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素的RPMI-1640培养液中，在37℃、含5%CO2的培养箱内培养传代。加药均在细胞对数生长期内进行。
2.药品与试剂
去甲斑蝥素(北京第四制药厂王广生教授惠赠)，在RPMI-1640内溶解，抽滤灭菌，-20℃保存。RNaseA和Proteinase K(E Merck)按分子克隆操作指南[7]分别配成10g/L和20g/L,-20℃存放。
3.剂量反应曲线
按参考文献[8]，取培养的肝癌细胞，以4×104/ml的密度接种于96孔板，每孔180μl。待细胞贴壁后，各孔继加20μl不同浓度的待试药物，每个稀释度作8个平行孔。置含5%CO2的37℃培养箱中培养48h。倒出培养液，生理盐水洗3次，每孔加入NAG酶反应底物保存液50μl，37℃继续孵育4h后，每孔再加入80μl酶反应终止液，立即置日本NJ-2000型酶标仪中测定各孔的OD值(检测波长405nm，参比波长490nm)。以不同浓度药物作用的培养孔的平均OD值对药物浓度作图，实验重复3次。
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4.细胞DNA片断的提取及琼脂糖凝胶电泳
参照文献[9]收集DNA片段，在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳，恒压33V；紫外透射仪上观察并摄片。
5.细胞形态学观察
5.1 一般形态学观察：收集适量细胞，离心涂片，风干固定。贴壁细胞，直接倒掉培养液，取出细胞附着的盖片，PBS洗。单层细胞标本以Wright-Giemsa染色，光镜下观察。
5.2 超微结构观察：细胞经常规2.5%戊二醛与1%锇酸固定后，逐级浓度酒精脱水，Spury Resin树脂包埋，超薄切片，枸橼酸铅-醋酸双氧铀电子染色，JEM-1200EX透射电镜观察。
6.免疫细胞化学法检测凋亡相关蛋白的表达
常规SABC法测定。用PLP(过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛)固定液固定细胞，一抗为兔抗人Bcl-2(1∶50, Santa Cruz Biotechnology, Inc),湿盒中4℃冰箱过夜。滴加生物素化二抗(1∶200, Vector laboratories, Inc)，室温30min，滴加辣根酶标记链霉亲和素(1∶400, Vector laboratories, Inc)，室温30min，DAB显色。结果经LEITZ DMRBE型显微分光光度计(Leica)定量：每组取3～5张有代表性的标本，随机框取90个细胞测定其平均光密度，结果用t检验统计分析。
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7.Western blotting分析
离心收集细胞约5×106个，加入100μl 2×点样缓冲液，沸水中煮10min，使细胞裂解，每个点样孔加25μl样品液，12.5%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。凝胶上的蛋白带转移到硝酸纤维素膜上，封闭液封闭膜上的免疫球蛋白结合位点，过夜。加入特异性的一抗(兔抗Bcl-2，1∶1 000)、生物素化二抗(1∶2 000)及辣根酶标记链霉亲和素(1∶2 000)，DAB显色。
结果
1.去甲斑蝥素对肝癌细胞的增殖抑制作用
图1示去甲斑蝥素作用BEL-7402细胞48h时剂量反应曲线，可见随着剂量的增加，去甲斑蝥素对肝癌细胞的抑制作用也明显增强。
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图1 去甲斑蝥素作用人肝癌BEL-7402细胞48h时的剂量反应曲线
Fig.1 Growth inhibition effect of increasing concentrations of
NCTD on the human hepatoma BEL-7402 cells at 48h. Points
are the mean of triplicate assays.
2.DNA琼脂糖凝胶电泳
如图2所示，10mg/L去甲斑蝥素处理BEL-7402细胞24h，可见以约200bp为基数的DNA片断组成的“梯状”带纹(ladder),而对照组没有。
3.细胞的形态学变化
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图3示正常对照组的BEL-7402细胞形态：细胞贴壁生长，胞浆伸展，境界清楚，基本形成致密单层。10mg/L去甲斑蝥素作用24h后(图4)，细胞收缩变形、脱壁，并出现一系列特殊的形态学变化：细胞多发生M期阻滞，一些细胞核染色体出现多极分离，部分染色体断裂，形成大小不一的染色质小块散在于胞浆中，部分细胞固缩，视野中还可以看到包有部分胞浆和染色质凝集块的小体，这些特征均与文献[10，11]报道的细胞凋亡时的形态学变化极为相似。图5示1个放大的正在凋亡的BEL-7402细胞，可见许多染色质小块靠细胞膜边集，细胞膜成泡状突出。电镜下，去甲斑蝥素处理组细胞膜表面微绒毛消失，细胞出现明显的固缩、染色质异常凝集、胞浆空泡化，可见形成的包有部分胞浆和部分染色质凝集块的小体(图6)。图7示正常对照组中1个分裂间期细胞的超微结构特征：细胞膜表面有较多细长微绒毛，细胞核大，核膜、核仁结构清晰，胞浆内分布有结构清晰的线粒体、内质网等细胞器。
4.免疫细胞化学及Western blotting分析Bcl-2蛋白的表达
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免疫细胞化学染色显示，Bcl-2蛋白存在部位有棕黄色反应物。阴性对照组无表达，正常对照组细胞染色呈棕褐色，表明它大量存在于这些细胞中。10mg/L去甲斑蝥素处理24h，细胞染色处于阴性对照组和正常对照组之间，呈浅棕黄色，表明处理组细胞中Bcl-2蛋白的表达仍较强，但与正常对照组相比，已有显著性差异：正常对照组细胞的平均光密度为0.12±0.01(n=90)，处理组细胞的平均光密度为0.08±0.01(n=90)，处理组中Bcl-2蛋白的表达明显低于正常对照组(P<0.001)。图8示Western blotting分析结果，可见10mg/L去甲斑蝥素处理BEL-7402细胞24h，仍可见Bcl-2蛋白的较强表达，但48h和72h，Bcl-2蛋白的表达已急剧减弱。
讨论
细胞凋亡是细胞主动参与并遵循一定程序的自我消亡过程，有其独特的形态和生化特征。形态学上最重要的是细胞核染色质异常凝集，核固缩、碎裂等，继而通过形成凋亡小体而消亡，生化特征最重要的是由于Ca2+、Mg2+依赖性的核酸内切酶的激活导致的核小体间DNA的断裂，DNA琼脂糖凝胶电泳时会出现规则的“梯状”带纹，我们对照这两方面特征，认为去甲斑蝥素是通过诱导BEL-7402细胞凋亡而抑制其生长的。
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近年来，关于细胞凋亡的基因调控机制研究已取得一些初步成果，有资料显示，癌基因bcl-2、c-myc、抑癌基因p53等可能在某些情况下参与了细胞凋亡过程[12]。在去甲斑蝥素诱导BEL-7402细胞凋亡过程中，我们发现，Bcl-2蛋白表达的变化非常显著，随着去甲斑蝥素作用时间的延长，处理组细胞中的Bcl-2蛋白表达下降，与细胞凋亡的发生发展进程相平行。以往的研究表明，癌基因bcl-2是一个凋亡抑制基因，它在多种肿瘤细胞中过度表达，使本该凋亡的细胞凋亡受阻，最终诱发肿瘤，而且，它的强表达还影响肿瘤细胞的抗药性。Dole等[13]用bcl-2表达载体(pSFFV-neo-bcl-2)转染bcl-2阴性人类神经母细胞瘤(NBL)细胞株(shep-1)，发现高水平bcl-2的克隆对cisplatin和etoposide引起的细胞毒性呈剂量依赖性阻抗，因此我们认为Bcl-2蛋白表达的这种减弱可能在去甲斑蝥素诱导的BEL-7402细胞凋亡过程中起重要作用。
细胞凋亡是一个连续的过程，在体内或对于没有同步化处理的培养细胞，同一时相可以看到发育不同时期的凋亡细胞(图4)。体外培养的人肝癌细胞经去甲斑蝥素作用后，首先变圆浮起，离心涂片后染色观察，发现这些细胞大多处于有丝分裂期。随着药物作用时间的延长，处理组细胞不断变圆浮起，而原来变圆的细胞不断地开始变形，表面突起，染色体多极分离、断裂，继而凝集成大小不一的块状，并不断形成包有部分胞浆或染色质块的小体。据此我们推测，去甲斑蝥素使人肝癌细胞发生M期阻滞与诱导其发生凋亡密切相关，进一步阐明这两者关系的研究正在进行中。
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图版说明
图2 BEL-7402细胞DNA琼脂糖凝胶电泳。M：分子量标准，pBR322 HinfI酶切，1：对照组，2：10mg/L NCTD作用24h
图3 对照组贴壁生长的BEL-7402细胞，W-G染色 ×350
图4 BEL-7402细胞经10mg/L NCTD作用24h后形态学变化。部分细胞有丝分裂后期染色体呈多极分离(↑)，有些染色体断裂，凝集形成大小不一的染色质小块散落在胞浆中(▲)，部分细胞固缩(↑)，可见形成的包有部分胞浆和染色质小块的凋亡小体(AB)，W-G染色 ×350
图5 10mg/L NCTD作用24h，示1个正在凋亡的BEL-7402细胞，可见其染色质凝集块靠细胞膜边集，细胞膜呈泡状突出，W-G染色 ×880
图6 示电镜下，10mg/L NCTD作用24h后BEL-7402细胞发生凋亡，形成的凋亡小体：染色质凝集，胞浆浓缩，凋亡细胞(↑)内质网扩张 ×14 000
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图7 示电镜下，对照组中1个间期BEL-7402细胞，可见其细胞核(N)、线粒体(M)、内质网(Er)等结构清晰 ×16 000
图8 Western blotting显示BEL-7402细胞中Bcl-2蛋白的表达。A：对照组，B:10mg/L NCTD作用24h，C：10mg/L NCTD作用48h，D：10mg/L NCTD作用72h。
Ecplanation of figures
Fig.2 Agarose gel electrophoresis of DNA extracted from BEL-7402 cells. M:DNA marker; 1:control group; 2:treated with 10μg/ml NCTD for 24h.
Fig.3 Control BEL-7402 cells, W-G staining ×350
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Fig.4 BEL-7402 cells treated with 10μg/ml NCTD for 24h. (↑)indicates multipolar distribution of chromosomes in postmitotic cells, (▲)indicates nuclear fragments in apoptotic cells, (↑) indicates condensed cells, (AB) indicates apoptotic bodies which containing one or two nuclear fragments. W-G staining ×350
Fig.5 An apoptotic BEL-7402 cell, some nuclear fragments moved to cell membrane which giving a bubbling aspect to the cell surface. W-G staining ×880
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Fig.6 Ultrastructural features of BEL-7402 cells treated with 10μg/ml NCTD for 24h. Endoplasmic reticulum (Er) dilated in the apoptotic cell(↑), the apoptotic bodies characterized by compaction of nuclear chromatin and condensation of cytoplasm ×14 000
Fig.7 Ultrastructural features of a BEL-7402 cell in control group. Note the clear structure of cell nucleus(N), mitochondrion(M), and Endoplasmic reticulum(Er) ×16 000
Fig.8 Western blotting analysis of Bcl-2 protein in BEL-7402 cells. A:control; B:treated with 10 mg/L NCTD for 24h; C:treated with 10 mg/L NCTD for 48h; D:treated with 10 mg/L NCTD for 72h
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* 高等学校博士学科点专项科研基金资助课题
△ Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029, China
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收稿1997-11 修回1998-03, 百拇医药
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